一、實驗原理

流式細胞術(flow cytometry, FCM)是一項新型的、發展迅速的生物醫學分析技術,它是集激光技術、光電測量技術、計算機技術、流體力學以及細胞免疫熒光化學技術 、單克隆抗體技術為一體的新型高科技細胞分析技術。

流式細胞儀是應用流式細胞術建立起來的儀器裝置。它使細胞或微粒在液流中流動,逐個通過一入射光束,并用高靈敏度檢測器記錄下散射光及各種熒光信號,從而得以對粒子進行多參數分析,包括諸如粒子形狀和大小、細胞周期、細胞內細胞因子、細菌表面抗原、細胞DNA內含物等。FCM檢測的粒子一般為活性細胞,通過激光光源激發細胞上所標記的熒光物質的強度和顏色以及散射光的強度可以得到細胞內部各種各樣的生物信息。另外FCM還可進行細胞分選,可以根據所檢測細胞的某種性質進行分選,并且如果分選的過程是在無菌條件下進行的,這些細胞還可以用來培養。流式細胞儀原理如下：

待測樣品(如細胞、染色體、精子或細菌等)經熒光染料染色后制成樣品懸液，在一定壓力下通過殼液包圍的進樣管而進入流動室，排成單列的細胞，由流動室的噴嘴噴出而成為細胞液流，并與入射激光束相交。細胞被激發而產生熒光，由放在與入射的激光束和細胞液流成 90°處的光學系統收集之。光學系統中的阻斷濾片用于阻擋激發光；二色分光鏡及另一些阻斷濾片則用于選擇熒光波長。熒光檢測器為光電倍增管。散射光檢測器是光電二極管，用以收集前向散射光。小角度前向散射與細胞大小有關。

整個儀器用多道脈沖高度分析器處理熒光脈沖信號和光散射信號。測定的結果用單參數直方圖、雙參數散點圖、三維立體圖和輪廓（等高）圖來表示。
    對細胞進行分選的原理是，由超聲振蕩器產生高頻振蕩，使流動室發生振動，把噴嘴噴出的細胞液流斷裂成一連串的均勻小液滴，有的液滴含有細胞。這些細胞在形成液滴前，光學系統已測定了它們的信號（代表細胞的性質），如果測得信號與所選定的要進行分選的細胞性質符合，或者說，如果發現了要進行分選的細胞時則在這個選定細胞剛形成液滴時，儀器給整個液流充以短暫的正或負電荷。當該液滴離開液流后，其中被選定細胞的液滴就帶有電荷，而不被選定的細胞液滴則不帶電。帶有正電或負電的液滴通過高壓偏轉板時發生向陰極或向陽極的偏轉，從而達到了分類收集細胞的目的。

二、應用簡介

醫學應用

1. HIV免疫分型，CD4絕對計數

2. 白血病和淋巴瘤的免疫分型

3. 腫瘤的細胞周期和倍體分析

4. 網織紅細胞計數

5. 細胞移植的交叉配型和免疫狀態監測

6. 干細胞計數

7. 殘量白血病細胞檢查

8. HLA-B27檢查

9. 血小板功能及相關疾病

科研應用

1. 在免疫研究學中的應用：

結合免疫熒光方法，流式細胞術可辨認和計數帶有不同表面特異性抗原的細胞，例如用熒光素標記的免疫球蛋白鑒別T和B淋巴細胞（圖3），根據細胞表面抗原的不同,進一步分辨出不同的T和B淋巴細胞亞群，以及測定每個細胞所帶抗原的數量、密度及其動力學參數等。也可用流式細胞分選技術將帶有“＋”和不帶有“－”的某種特異抗原的細胞群體分類收集，供研究其功能特性。

流式細胞術對于判斷免疫缺陷癥，如愛滋?。ǐ@得性免疫缺損綜合征）的重要特征，即T4和T8淋巴細胞比例改變（T4細胞大量減少）以及判斷自身免疫病和確定白血病、淋巴癌的表型等，都是非常有用的。此外，流式細胞術還可用于定量分析結合于細胞上的熒光素標記的外源凝集素，測定細胞表面積和熒光素結合位點的相對密度，結合細胞動力學測定每個細胞結合位點的數目，以及研究各種外源凝集素與細胞表面結合的競爭性等。

2. 在神經生物學研究中的應用：神經干細胞和神經祖細胞的特性研究；不同類型的神經細胞的鑒定和功能研究；檢測細胞活性，細胞凋亡和細胞周期等。

3. 在腫瘤研究中的應用：

腫瘤細胞一般都含有異常數量的 DNA。在大多數實體瘤和急性白血病中都發現有非整倍體的細胞，由于流式細胞術樣品制備方法簡單，測定結果精確，能快速得到有關DNA倍性的信息,因而能提供有價值的診斷數據。如果在測量 DNA含量的同時，再測定其他參數（如不同類型的中等纖維蛋白，蛋白質含量、細胞大小、核質比等）則可進一步提高診斷的可靠性。
   流式細胞術可在實驗和臨床中評價腫瘤化療和放療的作用，現在根據流式細胞術和細胞動力學數據來監視腫瘤治療的工作已經在實際工作中開展起來。
   此外，流式細胞術在血液學、微生物學、分子生物學等領域中也得到廣泛的應用。流式細胞術正在向高靈敏、高速度、多參數測量、獲取形態學信息等方面發展。

4. 在細胞生物學和分子生物學研究中的應用：

流式細胞術可用于測定細胞周期各時相細胞的百分比。通過測定細胞群體中每個細胞的DNA含量，得出DNA含量分布曲線。例如，在測定Hela細胞DNA含量分布曲線上，第一個峰是含有2CDNA含量的G1/G0（DNA合成前期/靜止期）細胞,其次一個峰是4CDNA含量的G2+M(DNA合成后期＋有絲分裂期)細胞，從2C～4C間的區域為S期（DNA合成期）細胞。采用繪圖法或計算機擬合法可計算出細胞周期各時相細胞占整個細胞群體的百分數。
    用流式細胞術可進行多參數分析，即同時測定一個細胞的多種性質。如散射光和熒光，或多種不同顏色的熒光。例如細胞經吖啶橙染色后，DNA發綠色熒光，RNA發紅色熒光。測定這兩種熒光就能同時得知一個細胞內的DNA和RNA含量。測定結果可用二維散點圖或三維立體圖表示。用這種方法可根據DNA和RNA含量而鑒別出G0與G1、M期和 G2期細胞。用流式細胞術與液體閃爍技術相配合,還可求得細胞通過G1、S和G2+M期的時間(T、Ts、T+M及其變異系數。近年利用抗溴脫氧尿苷(Brdurd)單克隆抗體能發現滲入到細胞 DNA內的溴脫氧尿苷。將此種熒光抗體技術與測定細胞 DNA含量相結合，是研究DNA合成和細胞周期的一種非常有用的技術。此外,流式細胞術還可測定細胞群體同步化的程度和所處的時期，鑒別死細胞和活細胞，利用熒光標記配體，還可定量測定細胞表面和內部的受體等。

5. 在高通量監測和新藥研發中的應用：細胞功能變化的研究；細胞周期和活性；新藥研發；培養基研發等。

6. 海洋生物學：富集和分析細菌、藻類、浮游植物等。

7. 微生物學：細菌和酵母檢測；熒光蛋白檢測。

8. 生物燃料

9. 遺傳學研究：

用流式細胞術測定染色體DNA含量,可得到染色體頻率分布圖，稱為流式染色體核型分析。同類型染色體出現一個峰，峰的面積代表這種類型染色體的豐度。流式染色體核型分析技術不僅能快速分析核型，而且能分選出不同類型的染色體,做成人類每條染色體的DNA文庫，可用于人類基因組研究、遺傳病和癌癥的診斷的研究。

三、實驗方法

Step1：制成單細胞懸液（組織樣本）

Step2：溶血（細胞樣本無需進行此步驟）

Step3：離心去上清

Step4：調整細胞密度

Step5：加入相應的標記抗體

Step6：孵育

Step7：洗滌后離心去上清

Step8：上機檢測

四、樣本送檢要求

五、案例展示

六、常見問題

1. 待測樣本量至少lml，樣本應在采集后6h內處理，不可使用冷凍的標本或溶血樣本。

2. 細胞活性要好，否則易發生非特異性熒光染色。

3. 確保標本上機檢測前的細胞濃度為1×106／ml，細胞濃度過低則直接影響檢測結果。

4. 操作方面，保證流式細胞儀在整個工作過程中處于最佳狀態，能保證定量檢測的準確性和檢測精度。使用標準樣品調整儀器的變異系數在最小范圍，分辨率在最好狀態，能避免在測量過程中儀器條件的變化引起的檢測誤差。

5. 在紅色熒光對藍色熒光散點圖上，還可見到細胞凋亡區向細胞壞死區遷移的軌跡，可能是凋亡細胞的DNA進一步降解的緣故。

6. 用Heochst 33342染料與細胞孵育的時間不宜過長，一般控制在20min之內為宜。如果太長可引起Heochst 33342的發射光譜由藍光向紅光的遷移，導致紅色熒光與藍色熒光的比例改變，從而影響結果的判斷。

七、 服務流程