一、實驗原理
細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30%的染色體DNA在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3’-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。
TUNEL實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。
過氧化物酶標記測定法原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產生很強的顏色反應，特異準確的定位出正在凋亡的細胞，因而可在普通光學顯微鏡下進行觀察。
毛地黃植物是地高辛的唯一來源。在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結合的配體，因而非特異性反應很低?？沟馗咝恋奶禺愋钥贵w與脊椎動物甾體激素的交叉反應不到1％，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細胞Fc受體非特異性的吸附作用。
二、應用簡介
本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養的或從組織中分離的細胞凋亡測定，還可應用于抗腫瘤藥的藥效評價，以及通過雙色法確定細胞死亡類型和分化階段。
三、實驗流程
四、 樣本送檢要求
五、 案例展示
六、常見問題
1、出現非特異性熒光標記
① 有些細胞或組織，例如平滑肌細胞或組織，nuclease或polymerase的酶活性水平較高，易導致出現非特異性的熒光標記。解決方法是，取細胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導致假陽性。
② 使用了不適當的固定液，例如一些酸性固定液，導致出現假陽性。建議采用推薦的固定液。
③ TUNEL檢測反應時間過長，或TUNEL檢測反應過程中反應液滲漏，細胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現非特異性熒光。注意控制反應時間，并確保TUNEL檢測反應液能很好地覆蓋樣品。
2、熒光背景很高
① 支原體污染。請使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。
② 高速分裂和增殖的細胞，有時也會出現細胞核中的DNA斷裂。
③ TUNEL反應過強?？梢杂?/span>試劑盒提供的TdT酶稀釋液稀釋TdT酶2-5倍后再按照說明書操作。稀釋后的TdT酶需當日使用。
④ 紅細胞中血紅蛋白導致的自發熒光產生嚴重干擾。此時宜選擇其它細胞凋亡檢測試劑盒。
3、標記效率低
① 使用乙醇或甲醇固定會導致標記的效率較低。
② 固定時間過長，導致交聯程度過高。此時宜減少固定時間。
③ 熒光淬滅。Fluorescence在普通光照10分鐘就會嚴重淬滅。解決方法是需注意避光操作。
④ 碘化丙啶雙染時，如果碘化丙啶染色過深會導致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激發產生的熒光，從而起到淬滅作用。解決方法是用較低濃度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶。
七、服務流程
病理學檢測
分子生物學檢測
免疫學檢測服務
細胞實驗服務
動物實驗平臺
