一、 實驗原理

SNP檢測服務是檢測染色體基因組中單個核苷酸的突變而引起的DNA序列的多態性的技術服務，SNP以單個堿基的顛換、轉換、插入和缺失等形式存在。作為第三代分子標記，SNP標記具有很大的發展潛力，被廣泛應用于生物、農學、醫學、生物進化等眾多領域，在分子遺傳學、藥物遺傳學、法醫學以及疾病的診斷和治療等方面發揮著重要作用。

SNP主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。與其它分子標記相比，SNP分辨率最高也最為豐富，覆蓋基因組范圍大，遺傳上比較穩定，在人類基因組中，估計平均每1000個堿基對就有1個SNP，估計其總數可達300萬個甚至更多，是繼微衛星之后的第三代遺傳標記。

SNP的分布不均勻，非轉錄序列中要多于轉錄序列，絕大多數位于蛋白的非編碼區。通常情況下是一種二等位基因的變異，多為轉換，即一種嘧啶堿基換為另一種嘧啶堿基，或一種嘌呤堿基換為另一種嘌呤堿基，轉換與顛換之比為2：1。SNP在CG序列上出現最為頻繁，而且多是C→T，因為CG中C即胞嘧啶常為甲基化的，自發脫氨后即變為胸腺嘧啶。

服務類型：

1.Taqman探針法(定性)

針對染色體上的不同SNP位點分別設計PCR引物和TaqMan探針，進行實時熒光PCR擴增。探針的5’-端和3’-端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。當溶液中存在PCR產物時，該探針與模板退火，即產生了適合于核酸外切酶活性的底物，從而將探針5’-端連接的熒光分子從探針上切割下來，破壞兩熒光分子間的PRET，發出熒光。通常用于少量SNP位點分析。

高分辨率熔解曲線分析（HRM）是近幾年興起的SNP研究工具，它通過實時監測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴增產物的結合情況，來判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點、是否是雜合子等都會影響熔解曲線的峰形，因此HRM分析能夠有效區分不同SNP位點與不同基因型。這種檢測方法不受突變堿基位點與類型的局限，無需序列特異性探針，在PCR結束后直接運行高分辨率熔解，即可完成對樣品基因型的分析。該方法無需設計探針，操作簡便、快速，成本低，結果準確，并且實現了真正的閉管操作。

2.SNaPshot法測SNP

主要是基于熒光標記單堿基延伸原理的分型技術，也稱小測序，主要針對中等通量的SNP分型項目。在一個含有測序酶、四種熒光標記ddNTP、緊臨多態位點5’-端的不同長度延伸引物和PCR產物模板的反應體系中，引物延伸一個堿基即終止，經ABI測序儀檢測后，根據峰的移動位置確定該延伸產物對應的SNP位點，根據峰的顏色可得知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型。對于PCR產物模板可通過多重PCR反應體系來獲得。該方法主要針對中等通量的SNP分型項目，通常用于10-30個SNP位點分析。

3.MassARRAy法（定量、多位點、高通量）

Sequenom公司的MassArray質譜系統在SNP分型市場上占有重要地位，是目前市場上擁有最高性價比的中高通量SNP分型檢測系統，通過激光激發DNA分子片段，再用飛行時間來判斷片段分子量的大小。該方法已經廣泛地應用于遺傳突變檢測、SNP分型，是目前唯一采用質譜法進行直接檢測的設備。MassARRAy法實驗設計靈活，分型結果準確性高，性價比高?？蓪蛋僦翑登Х輼颖緳z測，樣本通量從幾百到幾萬。是中高通量SNP分型服務性價比最優的分型方法，適用于GWAS實驗后續驗證以及關聯分析。

4.Illumina BeadXpress法

采用Illumina公司的BeadXpress系統進行批量SNP位點檢測，可以同時檢測1-384個SNP位點，往往用于基因組芯片結果確認，適合高通量檢測。微珠芯片具有高密度、高重復性、高靈敏度、低上樣量、定制靈活等特點，極高的集成密度，從而獲得極高的檢測篩選速度，在高通量篩選時可顯著降低成本。

5.直接測序法

在所有SNP的檢測方法中，對待檢測片段進行直接擴增、測序是最為準確的方法，也是SNP分析的金標準。純合型SNP位點的測序峰為單一峰型，而雜合型SNP位點的測序峰為套峰，因而很容易將其區分開來。通過直接測序方法進行SNP檢測的檢出率接近100%。該技術主要通過直接測序的方法來確定位點的基因型，這種分型方法準確性最高，但費用大。如果需要檢測的幾個SNP位點正好位于一個測序單元內(長度小于700bp)，則單個位點的分型費用可顯著降低，這種分型技術不失為一種良好選擇。對于準確性要求特別高或樣本量特別小(幾個或幾十個)的項目，這種分型技術很適合。

二、應用簡介

SNP可導致人類疾病，如癌癥、傳染性疾病、自身免疫性疾病等，SNP是研究人類家族和動植物品系遺傳變異的重要依據，因此被廣泛用于群體遺傳學研究和疾病相關基因的研究，在藥物基因組學、診斷學和生物醫學研究中起重要作用。
應用領域：

1. 遺傳圖譜繪制的標記；

2. 疾病診斷和疾病易感基因的鑒別；

3. 藥物基因組學研究和新藥篩選；

4. 藥物代謝和藥物遺傳學；

5. 法醫鑒定和個體識別；

6. 群體遺傳學研究和遺傳多態性分析；

7. 物種鑒定、菌種鑒定等。

三、實驗方法

A. 直接測序法：

a、樣品基因組DNA提??；

b、根據不同的區域進行引物設計、合成；

c、對所有樣品進行基因擴增并純化；

d、測序；

e、統計與分析。

B. TaqMan探針法：

a、樣品基因組DNA提取與質檢；

b、探針的設計、合成；

c、預實驗優化PCR反應體系；

d、熒光定量PCR按測；

e、SNP位點數據分析。

C. SNaPshot法：

a、樣品基因組DNA提取與質檢；

b、引物的設計、合成；

c、擴增反應；

d、延伸反應；

e、測序儀檢測；

f、數據分析

四、樣本送檢要求

五、案例展示

Taqman探針法(定性)

SNaPshot法測SNP

六、 常見問題

①??為保證待測目的區域測序真實可靠，引物設計應該使待測目的區域邊界距離上下游引物至少各50bp；?

②?引物設計建議使用在線方式，以保證成功率；?

③?為保證測序敏感性，PCR產物片段大小應在250bp－650bp范圍；?

④?為方便實驗，建議引物合成時分裝成1?管，方便將PCR與測序的引物分開；

⑤?為保證引物的特異性，建議引物設計后在NCBI上blast確認；?

⑥?為防止降解，PCR產物應盡快測序，否則應該保存在-20℃，且時間不宜過長；

⑦?為保證結果真實性，建議對關鍵點進行反向測序確認。?

七、 服務流程