一、 實驗原理

石蠟包埋組織切片包括固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等一系列步驟， 是組織學和病理學等形態學科的常規實驗方法。

1) 材料的采集與分割：采集材料應根據制片的目的和要求而定，材料要有代表性，無病蟲害或其它損傷。

2) 殺死與固定：利用藥劑迅速把細胞殺死，以保持材料本來的狀態和結構。

3) 脫水：目的是除去組織中的水分，便于透明、浸蠟、包埋等步驟的進行，因為這些程序中所用的藥品都不能與水混合，所以必須脫水。

4) 透明：目的是將脫水劑從材料中除去，使材料透明，增記折光系數；同時便于下步的浸蠟和包埋等程序（因為究竟不能溶解石蠟）。

5) 浸蠟：目的是逐漸除去透明劑,并為包埋劑所代替。

6) 包埋（埋蠟、沉床）

7) 修塊：將已包埋好的蠟塊切成小塊，每一小塊包含一塊材料。

8) 切片:用切片機（如旋轉切片機）將蠟塊切成連續的蠟帶。

9) 粘片:切下來的切片經過鏡檢（根據情況也可不檢），將符合要求的切片粘在潔凈的載玻片上。

10) 脫蠟、染色、脫水透明和封片:粘片后要經過脫蠟、染色、再次脫水透明，然后封片永久保存。

二、 應用簡介

石蠟組織包埋切片成為對器官、組織、細胞的形態結構和化學物質進行定性、定位及定量分析的重要工具。

組織制片技術與免疫學技術結合構成免疫組織（細胞）化學技術，利用抗原與抗體的特異性結合原理，檢測組織切片中細胞組織的多肽及蛋白質等大分子物質的定性和定位觀察研究。不論哪種免疫組織化學技術都包括抗體的制備、組織材料處理、制備玻片標本以及免疫染色。冰凍切片手續簡便，制片過程中抗原活性丟失少，但組織細胞形態較差；石蠟切片步驟繁多，制片中抗原活性有所減低，但組織細胞形態清晰，是免疫組織化學常規制備切片方法之一。一般石蠟包埋的組織切片用于檢測胞漿或核內的抗原，不宜做表面抗原染色，有人將新鮮組織浸泡于冷磷酸緩沖液內48小時，再固定于96%乙醇或其他固定液固定的組織切片，可用于表面抗原染色。乙醇、丙酮等固定劑對抗原破壞較輕，但結構保存較差。最常用的固定液有中性和緩沖福爾馬林，它可與蛋白質交叉結合封閉抗原，在進行免疫染色前，切片再用蛋白酶消化，以暴露抗原部位、增強抗原的反應。在石蠟切片上進行的常用的免疫組化染色有免疫酶組織化學技術中的PAP法（非標記過氧化物酶-抗過氧化物酶法）及親和免疫組織化學技術中的ABC法（抗生物素-生物素-過氧化物酶復合物技術），其特異性強、敏感性高。使用兩種染色法的組織切片都需先經第一抗體（各種抗血清）孵育；再經第二抗體或生物素標記的第二抗體孵育；后經PAP復和物或ABC復合物孵育，最后以DAB（二氨基聯苯胺）-H2O2液顯色呈棕黃色沉淀。常規復染、脫水、透明、封片成永久性玻片標本，光鏡下檢測常規或特殊染色法難以顯示的成分及其精確定位，可用于基礎研究及臨床病理研究及診斷。微波用于石蠟包埋切片免疫組織化學染色既簡化步驟又節省時間，且能促進免疫染色效果。

石蠟包埋組織流式細胞儀DNA含量分析是石蠟包埋組織切片與流式細胞術（flow cytometry，FCM）結合使用來測量DNA含量及倍體分析，這一結合是流式細胞儀在臨床應用中，特別是在腫瘤研究方面開拓了新的研究途徑。FCM是激光、電子和電子計算機、流體噴射技術的綜合發展應用，是快速定量分析細胞的技術，要求被檢細胞呈懸浮狀態。目前已可測量細胞的大小、體積、DNA含量、DNA合成速率、RNA含量、表面抗原、染色體等。由于制備樣品技術的原因，過去許多流式分析資料僅限于采用新鮮組織標本，Hedley等1983年首先報導了FCM分析石蠟包埋組織切片制備分散細胞懸液技術來進行DNA含量的檢測，從組織切片中能獲得足夠數量的單個細胞，且與新鮮組織分離獲得的單個細胞在形態及DNA含量組方圖上均極為相似。目前國內也在逐步開展這方面的研究。由于這種方法取材可在病理組織觀察或診斷基礎上進行，比活檢或手術切除標本更為準確，又可做回顧性研究分析；且對DNA檢測速度快、數據客觀可靠，在腫瘤診斷、預后的預測和治療反應上具有重要價值；利用過去的標本可成批制作細胞懸液、成批上機測試，避免了儀器調試狀態不同帶來的影響，石蠟包埋塊保存時間的長短對結果影響不大。

常規固定（多數用福爾馬林）、石蠟包埋的組織塊均可用于流式細胞術，但含苦味酸或汞的固定液均不宜使用。切片厚度以30～50微米為宜。切片脫蠟要干凈、徹底，否則制備出的細胞懸液中碎片多，影響測定。梯度酒精水化后用胃蛋白酶或胰蛋白酶消化，消化后鏡檢呈單個分散狀態；由于福爾馬林固定可使DNA和核蛋白產生共價交聯，影響DNA和染料的化學定量結合，導致熒光強度下降，蛋白酶可破壞其聯結，改善測定的組方圖質量，消化時間以能分散細胞及細胞碎片盡量少為適度，以100目尼龍篩網濾去未消化完的組織片，離心去上清液后，加入冰冷的70%酒精固定，放入4℃冰箱備用。上機前染色。DNA特異熒光染料主要有：（1）碘化丙錠（PI）；（2）溴化乙錠（EB）；（3）4，6-二脒基-二苯基吲哚（DAPI）。FCM檢測石蠟包埋組織細胞DNA含量可做為以形態學為基礎，多參數綜合診斷中的一個重要的新手段。由于儀器設備價格昂貴及制備樣品的諸多環節均可能影響測定的數據，限制了臨床的廣泛使用。

石蠟切片標本是形態計量技術的基礎形態計量技術是近年發展起來的一種新的定量檢測技術，用全自動圖像分析儀對組織和細胞內各種有形成分的數量、體積、長度及表面積等的圖像數據進行數學處理，以便對生物組織細胞及其結構成分的形態進行定量分析，如線粒體個數、內質網、細胞核及胞質面積、胰島的數量及各類細胞的數值、腎小體的數量和體積比以及Feulgen染色測定細胞核DNA原位定量等，使組織學及細胞學的研究由形態及定性觀察轉向形態定量化。形態計量是從石蠟組織切片或涂片以及組織的光鏡照片和電鏡照片上的各種結構獲取二維圖像數據，通過軟件程序處理，得出有價值的結構參數。這種數據準確性高、客觀性強、重復性好、可減少或彌補觀察者的主觀性差異。形態計量已應用于臨床病理診斷工作，包括非腫瘤病變與腫瘤病變。國內對非腫瘤性病變的研究已涉及到動脈粥樣硬化、肝硬變、前列腺肥大、克汀病、胰腺炎及精索靜脈曲張等；而對腫瘤病變的研究則是形態計量學在臨床研究的重點，目前較集中于消化道、肝、膀胱、乳腺和肺等器官的腫瘤。此外，在疾病的發生過程中把形態計量參數與功能變化指標有機地結合，有利于探討疾病的發病機制；形態計量參數對腫瘤病變的治療效果及預后判斷的估計亦有參考價值。

在形態計量學的研究中，首先是對樣品質量要求較高，例如制片過程中組織的收縮、膨脹與擠壓、切片厚度與方向，特別是切片染色技術，染色是使組織或細胞各成分能染成不同色澤而便于識別，提高待測成分圖像的可測性及其內在組分的表達性，使待測成分的色彩和亮度明顯清晰地區別于它的背景。采用常規染色、特殊染色以及免疫組織化學染色，可對不同著色的成分及反應物作形態定量測定；利用免疫組織化學和原位雜交技術使病灶染色，再作形態定量測量。其次是要找出特征結構參數或定量指標，可先檢測組織或細胞的各種可測參數或根據待測成分的形態特點設計一些參數，再用統計學方法篩選出有用的參數作定量測定。由于儀器昂貴，目前國內尚處在實驗研究階段，臨床上的廣泛應用尚有一定困難。形態計量技術與常規技術和其它新技術綜合研究方法的使用，具有較好的應用價值及效果。

隨著各種新儀器的問世和新技術方法的不斷建立與使用，石蠟切片技術也逐漸擴展、滲入許多新領域中，做為基礎技術提供有效的實驗或使用樣品。石蠟包埋組織切片還可用于細胞原位核酸分子雜交技術中，可對材料中被雜交的DNA分子進行定位、含量分析或觀察基因表達（mRNA）水平；聚合酶鏈式反應（PCR）技術可用于固定、石蠟包埋組織的DNA分析，使研究進入了分子水平，但在短期內這些技術尚不能做常規使用。

三、 實驗方法

1) 材料的采集與分割

2) 殺死與固定

3) 脫水

4) 透明

5) 浸蠟

6) 包埋（埋蠟、沉床）

7) 修塊

8) 切片

9) 粘片

10) 脫蠟、染色、脫水透明和封片

四、 樣本送檢要求

 五、 案例展示 

六、 常見問題

1、切片上卷或皺起：

①　切片刀角度過大或過小，調整角度以5°為宜。

2、切片有空洞及破碎不齊：

①　切片時慢一點，輕削組織。

3、切片有褶皺：

①　切片時對準蠟塊表面輕輕哈氣。

七、服務流程