一、實驗原理
免疫共沉淀是利用抗原和抗體的特異性結合以及細菌的Protein G或A能特異性地結合到免疫球蛋白的Fc片段的方法。其基本原理是在細胞裂解液中加入感興趣蛋白的抗體,孵育后再加入與抗體特異結合的結合于磁珠的Protein G或A,若細胞中存在與興趣蛋白相結合的目的蛋白,就可以形成蛋白復合物:“目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—Protein G或A”;最后通過免疫印跡實驗來檢測目的蛋白。
當細胞在非變性條件下被裂解時,完整細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。Co-IP確定的存在相互作用關系,但這種相互作用并不能確定使用直接作用還是間接作用。
1) 免疫共沉淀的優點
1. 相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的,處于天然狀態。
2. 蛋白的相互作用是在自然狀態下進行的,可以避免人為的影響。
3. 可以分離得到天然狀態的相互作用蛋白復合物。
2) 免疫共沉淀的缺點
1. 可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質-蛋白質相互作用;
2. 兩種蛋白質的結合可能不是直接結合,而可能有第三者在中間起橋梁作用;
3. 必須在實驗前預測目的蛋白是什么,以選擇最后檢測的抗體,所以,若預測不正確,實驗就得不到結果,方法本身具有冒險性。
二、應用簡介
Co-IP、ChIP、RIP、Pulldown作為常見的分子互作驗證方法。它們可以從檢驗的出發點來區分:co-IP、ChIP、RIP是利用已知的蛋白檢測體內相關蛋白、DNA、RNA,并通過蛋白抗體免疫沉淀分離目標蛋白、DNA、RNA。Pulldown則是根據已知RNA(RNA pulldown)或者已知蛋白(GST pulldown)體外檢驗相關蛋白。
Co-IP主要用于檢測蛋白質與蛋白質之間相互作用,是IP實驗的一種擴展, 基于IP反應的潛力,在樣品溶液中捕獲和純化主要目標(抗原等)及通過天然相互作用靶標結合的其他的大分子。此外,還可以利用Co-IP來確定在不同條件下的蛋白質相互作用。
三、 實驗方法
四、樣本送檢要求
五、案例展示
六、常見問題
1、實驗樣品制備方法準備:很重要!根據研究目的,檢測樣品可能是組織樣品,也可能是細胞樣品,不同樣品制備流程不太相同,目的蛋白表達量也有較大差別,必須選擇合適的樣品和樣品制備方法。
2、根據研究目的選擇適合的蛋白特異性抗體:非常重要!用于Co-IP實驗的抗體是針對目的蛋白的特異性抗體,最理想的是選擇一種能識別興趣蛋白質某個表位的抗體,且這個表位不會被任何其他蛋白質相互作用所掩蓋,比普通WB抗體要求高出很多;同時,抗體特異性和靈敏性盡可能高,才有可能有干凈的背景和較好的IP效果,所以必須選擇最適合的抗體用于Co-IP實驗。
3、未檢測到目得蛋白或蛋白很少:
4、目得蛋白高背景:
七、服務流程
病理學檢測
分子生物學檢測
免疫學檢測服務
細胞實驗服務
動物實驗平臺